تاریخچۀ الکتروفورز sds-page مطلب ارسالی از sara.Tavakoly
استفاده از این روش در تخمین وزن ملکولی پروتئین ها اولین بار توسط Shapiro و همکارانش در سال 1967 گزارش گردید و بعدها در 1969 محققینی به نام های Weber و Osborn این تجربه را تأیید کردند و سرانجام توسط Laemmli در 1970 به شکل امروزی ارائه گردید.امروزه استفاده از این تکنیک جهت تعیین وزن ملکولی پروتئین ها روش روتین و با اهمیت در آزمایشگاه های تححقیقاتی می باشد.این روش ضمن ساده بودن به میزان اندک نمونه جهت آزمایش نیاز دارد و دارای قدرت تکنیک مناسب جهت شناسایی و تعیین خلوص پروتئین هاست.
پروتئین های طبیعی دارای بار الکتریکی، وزن مولکولی و شکل فضایی متفاوتی هستند و این عوامل در حرکت الکتروفورتیکی پروتئین ها مؤثرند. Weber و Osborn نشان دادند که الکتروفورز ژل پلی آکریل آمید در حضور دترجنت یونی سدیم دودوسیل سولفات یا لوریل سولفات یکی از کارامدترین روش ها برای تعیین وزن ملکولی پروتئین های نمونه می باشد.
sara.Tavakoly
*** >>> استفاده از مطالب این وبلاگ بدون ذکر منبع جایز نیست <<< ***
برای بررسی نمونه ای که دارای رنج وسیعی از جرم های مولکولی متفاوت است , باید از ژلی که دارای منافذی با اندازه های متفاوت است (شیب منافذ) , استفاده کرد . در این ژل منافذ در بالای ژل بزرگ تر از منافذ پایین ژل است . در حین پیشرفت کار حرکت پروتئین ها بیشتر محدود می شود . در حضور یک ژل گرادیانت رنج وسیعی از جداسازی حاصل می شود و نسبت به یک ژل با غلظت یکسان , باندها بهتر نگه داشته می شوند .
تهیه ژل گرادیانت : ژلهای گرادیانت اگر چه از ژلهای با غلظت ثابت مشکل تر ریخته می شوند , اما رنج پهناوری از پروتئین ها را جدا سازی می کنند . بعلاوه اینکه محاسبه وزن مولکولی آنها خیلی ساده تر است , زیرا برخلاف ژلهایی که غلظت ثابت دارند , ارتباط بین Log اندازه مولکولها و میزان حرکت آنها در سرتاسر رنج جداسازی روی ژل , خطی است .
مواد و تجهیزات :
محلول ژل
ساکاروز (Sucrose)
گرادیانت میکر
پمپ پیریستالتیک با توانایی 1.6ml/min
لوله مخصوص پمپ
بهم زن مغناطیسی
یک دستگاه الکتروفورز , همراه صفحات شیشه ای و اسپیسرها و شانه مخصوص .
جایگاه ریختن ژل
منبع الکتریسیته
دستورالعمل :
1- جایگاه ریخته شدن ژل را نصب نمایید .
2- لوله پمپ را به محل اتصال خروجی گرادیانت میکر وصل کنید . سر دیگر آن را به پمپ متصل کنید . طول مدت ریخته گری ژل 5- 10min طول خواهد کشید . لوله دیگر را از پمپ به جایگاه ریخته شدن ژل وصل نمایید .
3- دو نوع محلول با غلظت های کم و زیاد را که در داخل مخزن های گرادیانت میکر ریخته خواهند شد , طبق جدول درست نمایید . این محلول ها دارای آمونیوم پرسولفات است ولی از ریختن TEMED در آنها خود داری نمایید . ژلهای 5-20% و یا 10-20% ژلهای مطلوبی هستند . هواگیری در این پروتوکل لازم نیست . محلول ها را میکس نمایید . محلول غلیظ تر را برای جلوگیری از پلیمریزاسیون در محیط یخ یا آب سرد قرار دهید . محلول غلیظ آکریل آمید ممکن است بدون حضور TEMED و فقط با آمونیوم پرسولفات اضافه شده , پلیمره شود .
4- TEMED را به آرامی به محلول درون مخزنها که در حال میکس شدن است , اضافه کنید . توجه کنید که اول محلول ژل را به گرادیانت میکر اضافه نمایید ( بدون اضافه کردن TEMED ) . فقط قبل از باز کردن شیر خروجی به ازای هر میلی لیتر 33 میکرو لیتر TEMED به محلول اضافه نمایید .
5- محلول غلیظ تر در مخزنی که میکسر دارد و خروجی آن به ژل متصل است , ریخته می شود . در هنگام پر کردن محفظه ژل , محلول غلیظ تر زود تر از همه وارد محفظه ژل می شود . وقتی که محلول غلیظ تر وارد محفظه ژل می شود , به ته آن می رود . محلول رقیق تر به مخزنی که همزن دارد , وارد می شود و بدین ترتیب محلول غلیظ کمی رقیق تر می شود .
6- شیر را باز کنید , تا این عمل انجام شود .سپس ببندید .
7- محلول رقیق وارد مخزن دارای میکسر می شود .
8- محلول در این مخزن میکس می شود .
9- شیر خروجی و پمپ را روشن کنید .
10-وقتی که شلنگ در حدود چند میلی لیتر از محلول غلیظ پر شد , شیر میان دو مخزن را باز کنید . پمپ تا زمانی که محفظه ژل پر شود , روشن باقی می ماند .
11-روی سطح ژل را با 0.3ml آب اشباع شده با n-butanol بپوشانید و صبر کنید تا پلیمریزاسیون انجام شود . سپس ژل بالا (stacking gel)را بریزید .
*** >>> استفاده از مطالب این وبلاگ بدون ذکر منبع جایز نیست <<< ***
جدول تعیین درصد ژل آکریل آمید و آگاروز برحسب جرم مولکولها
درصد آکريل آميد مناسب براي جداسازي پروتئين هايي با جرم هاي مولکولي متفاوت
از ژل 12.5 درصد به بالا مولکول هایی که جرم آن بالاتر است در ژل حرکت و معنای چندانی ندارد . مثلا در ژل 12.5 درصد ماکزیمم جداسازی 100 می باشد , پس مولکول هایی که جرم آنها بزرگتر از 100 است , در ژل حرکت چندانی ندارند .
درصد آگاروز مناسب براي جداسازي DNA
*** >>> استفاده از مطالب این وبلاگ بدون ذکر منبع جایز نیست <<< ***
یک رادیکال آزاد که به عنوان یک آغازگر , پلیمریزاسیون ژل آکریل آمید را سبب می شود , از یکی از این دو راه تولید می شود . پروکسید یا روش فوتوشیمی . عمومی ترین روش استفاده از آمونیوم پرسولفات به عنوان یک پروکسید آغازگر است . و از TEMED به عنوان یک تسریع کننده یا (کاتالیزور) استفاده می شود .
برای پلیمریزاسیون به روش فوتوشیمی از ریبوفلاوین riboflavin و اشعه UV به عنوان آغازگر استفاده می شود و از TEMED به عنوان یک کاتالیزور استفاده می شود . به محلول ژل اشعه ماوراء بنفش تابانده می شود . یک لامپ فلورسنت واکنش فوتوشیمی را آغاز خواهد کرد .
پلیمریزاسیون به روش فوتوشیمی در مواقعی که باید قدرت یونی در ژل پایین باشد , مورد استفاده قرار می گیرد . زیرا در این روش فقط یک مقدار بسیار جزئی از ریبوفلاوین لازم است . همچنین در مواقعی که پروتئین در مقابل آمونیوم پرسولفات خیلی حساس است یا به وسیله پروکسید وارد پلیمریزاسیون می شود , از این روش استفاده می گردد .
پلیمریزاسیون آکریل آمید یک واکنش گرمازاست . پلیمریزاسیون سریع گرمای زیادی تولید می کند . این امر انتقال برق را در ساختمان ژل ناهمگون می نماید و گاهی باعث شکسته شدن شیشه آن می شود . این مشکل به طور ویژه در ژلهایی با غلظت بالا (>T 20% ) دیده می شود . برای جلوگیری از گرمای زیاد باید غلظت آغازگر – کاتالیزور را طوری تنظیم کرد , که پلیمریزاسیون در مدت 20-60min کامل شود .
*** >>> استفاده از مطالب این وبلاگ بدون ذکر منبع جایز نیست <<< ***
(2): محلول ثبوت دو : 40ml اتانول و 10ml اسید استیک را توسط آب مقطر به حجم 100ml برسانید.
(3): محلول گلوتار آلدهید 10%: 20ml از محلول استوک 50% گلوتار آلدهید را با آب مقطر به حجم 100ml برسانید.(به علت گرانی این ماده می توان از محلول رقیق تر استفاده کرد ولی زمان بیشتری را در نظر گرفت )
(4): محلول رنگ آمیزی (محلول نقره آمونیاکی): 21ml محلول هیدروکسید سدیم 0.36% و 1.95mlمحلول آمونیاک 25% را در یک ارلن بریزید. سپس در یک لوله آزمایش ، 0.8g نیترات نقره و 4ml آب مقطر ریخته ، حل می کنیم . محلول نیترات نقره را ، قطره قطره به محتویات ارلن اضافه کنید.
در صورت دیدن رسوب قهوه ای ، به آن دو قطره آمونیاک اضافه کنید و ظرف را تکان دهید تا محلول شفاف شود . حجم نهایی را به 100ml برسانید.
(5): محلول ظهور : 10mg اسید سیتریک و 0.1ml فرمالدهید (35%) را به حجم 200ml برسانید .
(6): محلول متوقف کننده : محلول متوقف کننده همان محلول ثبوت دو (2) می باشد .
مراحل رنگ آمیزی :
1- ابتدا ژل را توسط آب مقطر و درون ظرفی که روی شیکر قرار دارد به مدت 5 دقیقه بشویید.
2- اب مقطر را از ظرف خارج نمایید .
3- محلول ثبوت (1) را روی ژل ریخته ، جوری که روی آن را بپوشاند. به مدت 20 الی 30 دقیقه آن را شیک نمایید.
4- محلول ثبوت (1) را خارج کرده ، محلول ثبوت (2) را به ظرف اضافه نمایید . 20 دقیقه آن را شیک نمایید.
5- ژل را 2 بار و هر بار به مدت 5 الی 10 دقیقه با آب مقطر فراوان شیک نموده ، تا خوب شسته شود .
6- 100ml محلول گلوتارآلدهید را به ظرف اضافه کرده ، به مدت 20 الی 30 دقیقه آن را شیک نمایید.
7- پس از خارج کردن محلول ، ژل را 4 بار ، هر بار به مدت 5 دقیقه ، توسط آب مقطر شیک نمایید و بشویید.
8- محلول رنگ آمیزی را به ظرف اضافه کرده ، آن را به مدت 30 دقیقه شیک نمایید.
9- پس از خارج کردن محلول ، ژل را 3 بار ، هر بار به مدت 5 دقیقه ، توسط آب مقطر شیک نمایید و بشویید.
10- 100ml محلول ظهور را به ظرف اضافه کرده ، ظرف را تا ظهور باندها ، بسیار آرام تکان دهید.
11- پس از ظهور باندها به صورت مطلوب ، قبل از تیره شدن زمینه ژل ، محلول ظهور را به سرعت خارج کرده ، محلول متوقف کننده را اضافه نمایید.
*** >>> استفاده از مطالب این وبلاگ بدون ذکر منبع جایز نیست <<< ***
اين روش رنگ آميزی به حساسيت روش نقره است و تنها یک ساعت طول می کشد. این روش رنگ آميزی نگاتيو است که در آن زمينه ژل به جاي پروتئين ها رنگ می شود. رنگ به صورت کمپلکسي از "SDS" و ايميدازول روی و به رنگ سفید کدر در ژل رسوب ميکند . مناطقی از ژل که حاوی پروتئين هستند شفاف باقی می مانند . برهم کنشی بين رنگ و پروتئين وجود ندارد ودر صورت نياز، ژل را کاملاٌ می توان رنگ زدايی کرد . اين روشها را برای ژلهای 2-D آناليتيکال و ژلهای SDS-PAGE هم می توان بکار برد . برای ژلهای نازک تر ( کمتر از يک ميلی متر ) زمان انکوباسيون در روش ايميدازول- روی را می توان کاهش داد . تکه ژلهايی که توسط ايميدازول- روی رنگ آميزی شده اند را می توان توسط اسيد سيتريک 2% رنگ زدايی کرد .
1- بعد از اتمام الکتروفورز , ژل را به مدت 20min در محلول تثبیت کننده غوطه ور نمایید .
2- محلول را دور ریخته و ژل را 2 بار به مدت 15min در آب مقطر , توسط شیکر به آرامی شیک نمایید .
3- در محلول شماره 3 به مدت 15min و در انکوباتور , توسط شیکر به آرامی شیک نمایید .
4- محلول شماره 3 را دور ریخته و محلول شماره 2 را به آن اضافه نمایید . 30 الی 60 ثانیه شیک نمایید .
5- وقتی رنگ رضایت بخشی ظاهر شد , می توانید محلول را دور ریخته و به جای آن آب مقطر به ژل اضافه کنید .
در این روش رنگ آمیزی , ژلها اندکی شکننده تر به نظر مي رسند و درصورت نگهداری طولانی مدت مستعد خشک شدن هستند. ضمناً برای مشاهده نياز به زمينة تيره دارند. همچنین می توانید این روش را همراه با روش کوماسی بلو انجام دهید . به نحوی که پس از رنگ آمیزی کوماسی بلو , مراحل 2 تا 5 را انجام دهید .
*** >>> استفاده از مطالب این وبلاگ بدون ذکر منبع جایز نیست <<< ***
اين روش درکمتر از 2 ساعت پروتئين ها را در يک زمينه تميز و با حساسيتی درحدود روش نقره رنگ آميزی می کند. افزودن اتانول و سولفات آمونيوم به محلولی از آبی کوماسی G-250 در اسيد فسفريک رقيق، رنگ مذکور را به سمت شکل کلوئيدی آن سوق می دهد. در طی رنگ آميزی ، تعادلی بين اشکال کلوئيدی وفرم پراکنده مولکولی رنگ وجود دارد . فرم پراکنده رنگ وارد ماتريکس ژل شده و پروتئين ها را رنگ می کند. در حالی که فرم کلوئيدی بيرون نگه داشته می شود و به اين ترتيب از رنگ آميزی زمينه پرهيز می شود.
تهیه 1000ml محلول رنگ آمیزی :
100ml از محلول آمونیوم سولفات 10% , 20ml از محلول کوماسی بلو 0.1% , 30ml از محلول اورتو فسفریک اسید 3% , 200ml از محلول اتانول 20% , 650ml آب مقطر
نحوه رنگ آمیزی :
1- پس از الکتروفورز، ژل را 2 بار به مدت 3min در آب مقطر , توسط شیکر به آرامی شیک نمایید.
2- ژل را در محلول رنگ آمیزی کوماسی بلو کلوئيدی به مدت 2 ساعت قرار دهید .
3- باندها باید بدون رنگ زدایی دیده شوند , اما می توانید با آب مقطر نیز رنگ زدایی کنید .
نکات مهم :
1- محلول رنگ را پيش از استفاده نبايد صاف کرد .
2- بلافاصله بعد از رنگ آمیزی با این روش از ژل مورد نظر عکس برداری شود ، زیرا پایداری رنگ آمیزی با این روش کم است (حدود یک الی دو ساعت).
*** >>> استفاده از مطالب این وبلاگ بدون ذکر منبع جایز نیست <<< ***
مواد ذکر شده را در 250ml آب مقطر حل نمایید . این محلول در یک شیشه قهوه ای (تیره) و در دمای 4c هفته ها قابل استفاده می باشد .
استوک بافر ژل جدا کننده :
SDS : 1.0g
تریس : 45.5g
مواد ذکر شده را در کمتر از 250ml آب مقطر حل نمایید . pH را به 8.8 برسانید . سپس حجم را به 250ml برسانید .این محلول در دمای 4c ماه ها قابل استفاده می باشد .
استوک بافر ژل متراکم کننده :
SDS : 1.0g
تریس : 15.1g
مواد ذکر شده را در کمتر از 250ml آب مقطر حل نمایید . pH را به 6.8 برسانید . سپس حجم را به 250ml برسانید .این محلول در دمای 4c ماه ها قابل استفاده می باشد .
محلول استوک آمونیوم پر سولفات :
آمونیوم پر سولفات: 1.0g
ماده ذکر شده را در 10ml آب مقطر حل نمایید. این محلول در یک شیشه قهوه ای (تیره) و به صورت تازه مصرف شود . پیشنهاد اینجانب این است که در 10 میکروتیوب تقسیم شده و در فریزر نگهداری شود و جهت استفاده یکی از آنها را در آورده ، در یک نوبت مصرف نمایید .
بافر مخزن :
SDS : 2.0g
تریس : 6.0g
گلایسین : 28.8g
مواد ذکر شده را در کمتر از 2L آب مقطر حل نمایید . pH را به 8.3 برسانید . سپس حجم را به 2L برسانید .این محلول باید به صورت تازه مصرف شود .
استوک Sample بافر :
SDS : 0.92g
تریس : 0.3g
گلیسرول : 4.0g
برومو فنول بلو : 0.1 % (w/v )
بتا – مرکاپتو اتانول : 2.0ml
مواد ذکر شده را در کمتر از 20ml آب مقطر حل نمایید . pH را به 6.8 برسانید . سپس حجم را به 20ml برسانید .این محلول در دمای 4c هفته ها قابل استفاده می باشد .
محلول رنگ آمیزی :
کماسی بلو G-250 : 0.5g
متانول : 12.5ml
استیک اسید : 18.75ml
ابتدا رنگ را در متانول حل نمایید . سپس اسید استیک اضافه کنید و با آب مقطر به حجم 250ml برسانید .
محلول رنگ بر :
متانول : 100ml
استیک اسید : 100ml
آب مقطر : 800ml
محلول را به صورت تازه استفاده نمایید .
*** >>> استفاده از مطالب این وبلاگ بدون ذکر منبع جایز نیست <<< ***
SDS-PAGE تکنیکی است که در آن مولکولهای زیستی بر اساس اندازه جداسازی می شود . مولکولهایی چون انواع پروتئین ها , RNA , DNA . ژل آگاروز برای درشت مولکولهایی مانند DNA بهترین گزینه است . SDS-PAGE برای پروتئین های کوچکتر بهتر است .
مواردی که SDS-PAGE کاربرد دارد عبارت است از :
۱- تصدیق اندازه پروتئین ها
۲- شناسایی پروتئین ها
۳- تعیین خلوص پروتئین ها
۴- شناسایی پیوند های دی سولفید
۵- کمیت و مقدار پروتئین ها
۶- آشکار کردن عیوب
SDS یک دترجنت و مخفف sodium dodecyl sulfate می باشد . بعد از اضافه کردن آن , و احاطه کردن پروتئین ها , پروتئین ها بار نسبتا همسان پیدا کرده و به صورت خطی در می آیند . بدین ترتیب جداسازی فقط بر اساس اندازه صورت می پذیرد . تعداد مولکولهای SDS متناسب با تعداد آمینواسیدهای یک پروتئین است . هر مولکول SDS دو بار منفی به پروتئین می دهد . همچنین باعث می شود که نیرو هایی که در تا شدن و تغییر شکل دادن پروتئین ها شرکت می کنند , از بین بروند .
ژل پلی اکریل آمید همانند ژل آگاروز بر اساس اندازه مولکولها , جداسازی می کند . ژل اکریل آمید با پیوندهای عرضی که دارد , مکانی را برای الک کردن مولکولهایی که در اثر جریان الکتریکی در حال عبور می باشند , به وجود می آورد . همه پروتئین هایی که دارای بار منفی هستند , توسط انتهای میدان الکتریکی که دارای بار مثبت می باشد , کشیده می شود , اما شبکه پلیمری در برابر حرکت آنها مقاومت می کند . پروتئین های کوچکتر سریعتر از مولکولهای درشت تر در این شبکه , حرکت می کنند . در نتیجه از مولکولهای درشت تر پایین تر قرار می گیرند . پس جداسازی در روش SDS-PAGE فقط بر اساس اختلاف در اندازه مولکولها می باشد .
پس از اینکه ژل Run شد , شما احتیاج دارید که پروتئین ها را بر روی ژل فیکس کنید . تا پروتئین ها از جای خود حرکت نکند . اسید استیک 25% یک فیکس کننده خوب است و باعث دناتوره شدن پروتئین می گردد . ژل توسط یک رنگ مثل coomasie blue R250 رنگ می شود . رنگ و تثبیت کننده را می توان در یک محلول که حلال آن متانول است به طور همزمان استفاده کرد . رنگ در کل ژل پخش شده و با پروتئین ها کمپلکس می شود(staining) . سپس با یک محلول که حاوی اسید استیک و متانول است ژل شسته می شود تا رنگ از ژل خارج شود و فقط رنگی که با پروتئین ها باند شده است باقی بماند (destain).
بدون SDS , پروتئین با ساختمان اولیه خود و بدون تغییر بار جداسازی می شود , که در این روش جرم مولکولی و بار isoelectric در جداسازی تآثیر گذار است و این روش PAGE نام دارد . SDS تقریبا به نسبت 1.4g برای هر یک گرم پروتئین استفاده می شود .(این نسبت بین 1.1g الی 2.2g SDS برای هر گرم پروتئین تغییر می کند) .
اندازه منافذ SDS-Polyacrylamide Gel Electrophoresis :
بیشتر پروتئین ها و نوکلوئیک اسیدها با اندازه و شکل های متفاوت دارای ضریب بار/جرم تقریبا یکسانی هستند . الکتروفورز این مولکولها در محیط مایع , باعث جداسازی مناسبی نمی شود . اما الکتروفورز در محیط ژل (سوسپانسیون نیمه جامد در آب) نتیجه بهتری می دهد . جداسازی پروتئین ها بطور معمول در ژلهای پلی اکریل آمید انجام می شود . این ژل ها توسط پلیمره شدن محلولی از مونومر اکریل آمید که قالب آن از دو شیشه تشکیل شده است , درست می شود . میزان درشتی و ریزی منفذهای پلیمر متناسب است با غلظت پلی اکریل آمید و عامل بوجود آورنده پیوند های عرضی. وقتی یک مخلوط از پروتئین در ژل و در میدان الکتریکی ایجاد شده قرار می گیرد , پروتئین های کوچکتر سریعتر از درشت مولکولها از میان منافذ ژل حرکت می کنند . میزان جابجایی به اندازه منافذ ژل و قدرت میدان الکتریکی بستگی دارد . پس مولکولهای کوچکتر راحت تر از منافذ عبور کرده , در حالی که درشت مولکولها به راحتی جابجا نمی شوند .
در این متد مخلوط پروتئین و SDS که یک دترجنت آنیونی است , توسط گرما با هم باند شده اند . لذا پروتئین ها دیگر ساختمان اولیه را ندارند و فاقد پیوندهای دی سولفید هستند .
ردیابی رنگ در الکتروفورز :
رنگ به کار رفته در محلول پروتئین به آزمایش کننده این امکان را می دهد که متوجه شود پروسه چه میزان پیش رفته است و آیا مدت زمان جداسازی کافی بوده است یا خیر .
عناصر سازنده شیمیایی و نقش آنها :
اندازه مناذ را 2 فاکتور کنترل می کند .(T%) مقدار درصد acrylamide و مقدار پیوندهای عرضی (C%) . کل غلظت مونومر acrylamide-bisacrylamide = T و غلظت عامل پیوند دهنده عرضی = C . اندازه منافذ با افزایش T% کاهش می یابد و با عامل پیوند دهنده عرضی 5% کوچکترین اندازه منفذ را می دهد . هرگونه افزایش و یا کاهشی در C% باعث افزایش اندازه منفذ می شود , زیرا رابطه اندازه منفذ با C% یک رابطه پارابولیک (سهمی گونه) است . و مینیمم آن در 5% می باشد . دو لایه در ژل وجود دارد . یکی stacking و دیگری separating .
*** >>> استفاده از مطالب این وبلاگ بدون ذکر منبع جایز نیست <<< ***
پذیرش مقالات ,آموزش , مشاوره و شرکت در طرحهای تحقیقاتی و تولیدی و پایان نامه های دانشجویی در رابطه با تخلیص پروتئین ها با روشهایی مثل الکتروفورز کروماتوگرافی و غیره (وابسته به مؤسسه تحقیقات واکسن وسرم سازی رازی ، کرج)
روز بخير كاربر مهمان! 
